Javascript está actualmente deshabilitado en su navegador.Varias características de este sitio no funcionarán mientras javascript esté deshabilitado.acceso abierto a la investigación científica y médicaRevistas científicas y médicas de acceso abierto revisadas por pares.Dove Medical Press es miembro de la OAI.Reimpresiones masivas para la industria farmacéutica.Ofrecemos beneficios reales a nuestros autores, incluido el procesamiento rápido de artículos.Registre sus detalles específicos y medicamentos específicos de interés y compararemos la información que proporcione con los artículos de nuestra extensa base de datos y le enviaremos copias en PDF por correo electrónico de inmediato.Volver a Revistas » Infección y resistencia a los medicamentos » Volumen 12Desarrollo, optimización y validación de una prueba rápida Dot-ELISA interna basada en las proteínas SAG1 y GRA7 para la detección serológica de infecciones por Toxoplasma gondiiAutores » Teimouri A, Modarressi MH, Shojaee S, Mohebali M, Rezaian M, Keshavarz HPublicado el 27 de agosto de 2019 Volumen 2019:12 Páginas 2657—2669DOI https://doi.org/10.2147/IDR.S219281Revisión por revisión por pares anónimos únicosEditor que aprobó la publicación: Dr. Sahil KhannaAref Teimouri,1,2 Mohammad Hossein Modarressi,3 Saeedeh Shojaee,1 Mehdi Mohebali,1,4 Mostafa Rezaian,1 Hossein Keshavarz1,4 1Departamento de Parasitología Médica y Micología, Universidad de Ciencias Médicas de Teherán, Teherán, Irán;2Centro de Investigación Científica para Estudiantes, Universidad de Ciencias Médicas de Teherán, Teherán, Irán;3Departamento de Genética Médica, Facultad de Medicina, Universidad de Ciencias Médicas de Teherán, Teherán, Irán;4Centro de Investigación de Parásitos Endémicos de Irán, Universidad de Ciencias Médicas de Teherán, Teherán, Irán Correspondencia: Hossein Keshavarz Department of Medical Parasitology and Micology, School of Public Health, Tehran University of Medical Sciences, PO Box 1417613191, Pour Sina Street, Ghods Avenue , Enghelab Avenue, Tehran, Iran Tel +98 218 895 1392 Fax +98 218 895 1392 Email [email protected] Antecedentes: El objetivo del presente estudio fue desarrollar un ensayo simple, portátil y rápido para el serodiagnóstico de la toxoplasmosis basado en recombinante Toxoplasma gondii (T. gondii) Proteínas SAG1 (rSAG1) y GRA7 (rGRA7).Métodos: Las proteínas rSAG1 y rGRA7 se expresaron en Escherichia coli (E. coli) y se purificaron en un solo paso mediante cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados.La inmunorreactividad de los antígenos recombinantes se analizó en un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (Dot-ELISA) interno para IgG e IgM Dot para su posible uso en el serodiagnóstico de la infección por T. gondii.Resultados: Los resultados de la comparación de rSAG1-Dot-ELISA interno con ELISA para la detección de IgG e IgM anti-Toxoplasma incluyen una sensibilidad del 83,7 % y el 81,2 %, una especificidad del 90,2 % y un 89,3 % y valores predictivos positivos del 85,9 %. y 68,4%, y valores predictivos negativos de 88,6% y 94,3%, respectivamente.La sensibilidad del 66,2 %, la especificidad del 81,2 %, los valores predictivos positivos del 71,6 % y los valores predictivos negativos del 77,1 % se concluyeron a partir de IgG rGRA7-Dot-ELISA interno.La sensibilidad y especificidad de IgM rGRA7-Dot-ELISA incluyeron 87,5% y 83,9%, respectivamente.La sensibilidad y especificidad del Dot-ELISA interno para una combinación de rSAG1 y rGRA7 incluyeron 87,5 % y 91,1 % para IgG e IgM, respectivamente.La sensibilidad y especificidad de una combinación de rSAG1 y rGRA7 para la detección de IgM en sueros sospechosos de toxoplasmosis aguda fueron superiores a las de la detección de IgG en sueros con infecciones crónicas (90,6% y 92% en lugar de 86,2% y 91,6%, respectivamente). ).Conclusión: Los parámetros destacados de las proteínas recombinantes combinadas fueron más significativos que los de las proteínas recombinantes individuales en Dot-ELISA interno.Estos datos sugieren que el Dot-ELISA interno basado en la combinación de rSAG1 y rGRA7 es una herramienta de diagnóstico prometedora con una sensibilidad similar a los antígenos nativos de T. gondii, que se puede utilizar para el serodiagnóstico de toxoplasmosis en el campo, así como en menos laboratorios equipados.Palabras clave: cepa RH de Toxoplasma gondii, Dot-ELISA interno, rSAG1, rGRA7, antígeno de taquizoíto soluble (STAg), proteínas recombinantesToxoplasma gondii (T. gondii; agente de la toxoplasmosis) es un parásito intracelular ubicuo capaz de infectar una amplia variedad de animales de sangre caliente y humanos.1 Los humanos pueden infectarse a través de la ingestión de alimentos y agua contaminados con ooquistes y el consumo de alimentos crudos o poco cocidos. carnes que contienen quistes de tejido T. gondii.La transmisión vertical de taquizoítos de T. gondii que se dividen rápidamente de madres embarazadas a fetos en desarrollo es otra ruta de infección humana.2 Generalmente, la infección por T. gondii es asintomática en individuos inmunocompetentes.Sin embargo, la infección puede provocar enfermedades graves en fetos y pacientes inmunocomprometidos, incluidos aquellos con VIH/SIDA, cáncer o trasplante de órganos.3 Hasta la fecha, se han utilizado varios métodos para el diagnóstico de toxoplasmosis, incluido el aislamiento microbiano, el análisis de técnicas inmunológicas (serológicas) y moleculares.De estos métodos, los métodos serológicos se usan más comúnmente para la detección de clases de anticuerpos o antígenos específicos contra la toxoplasmosis.4 La mayoría de los kits serológicos disponibles comercialmente para el diagnóstico de la toxoplasmosis usan antígenos totales del parásito preparados a partir de taquizoitos en ratones y/o cultivos de tejidos en in vitro y posiblemente contienen cantidades variables de material parasitario extra.5,6 Sin embargo, a veces se observa variabilidad entre ensayos debido a la falta de antígenos estándar o protocolos adecuados para la preparación de estos antígenos.Normalmente, la preparación de estos antígenos es costosa.Además, las preparaciones comúnmente incluyen componentes derivados de células huésped.Además, el uso de parásitos vivos en la preparación de antígenos puede provocar graves problemas de salud.Para resolver estos problemas, ahora se producen antígenos usando tecnología de ADN recombinante.7 Relativamente, recientemente se han clonado y expresado genes diana de T. gondii usando varios sistemas.De estas proteínas recombinantes, los antígenos de superficie (SAG), los antígenos de matriz (MAG), las proteínas de micronemas (MIC), las proteínas de roptría (ROP) y los antígenos de gránulos densos (GRA) son las proteínas más utilizadas en la literatura.8 Los estudios han descrito la uso exitoso de proteínas antigénicas recombinantes para detectar anticuerpos específicos contra T. gondii.Estos estudios analizaron antígenos recombinantes por separado y combinados entre sí para aumentar la sensibilidad diagnóstica.9,10 En el estudio actual, se eligió SAG1 porque es uno de los antígenos de T. gondii más inmunogénicos y específicos de etapa, presente en taquizoítos pero no en bradizoíto.11 Otra proteína elegida fue GRA7 porque provoca una potente respuesta de anticuerpos en las fases agudas de la infección.12Hoy en día, los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) se utilizan ampliamente en diagnósticos de rutina e investigaciones seroepidemiológicas utilizando proteínas recombinantes purificadas.Sin embargo, el ensayo es costoso, laborioso y requiere mucho tiempo y requiere operadores expertos, materiales y equipos especiales.13,14 Estos requisitos a veces no están disponibles en países con recursos limitados.Por lo tanto, es necesario un ensayo fácil de operar, rentable y rápido como Dot-ELISA para el diagnóstico temprano de toxoplasmosis en clínicas y campos.Dot-ELISA, como una técnica ELISA modificada en la que la interacción antígeno-anticuerpo se realiza en membranas de nitrocelulosa (NC), se ha desarrollado para detectar antígenos o anticuerpos.15 En 1983, Pappas et al introdujeron por primera vez Dot-ELISA para el serodiagnóstico de leishmaniasis visceral humana (LV) y luego estandarizó el ensayo.16 Dot-ELISA se ha utilizado para el diagnóstico de helmintos como Fasciola gigantica en ovejas infectadas experimentalmente, Trichinella spiralis en cerdos y Haemonchus contortus en suero de ovejas.Además, esta técnica ha sido ampliamente utilizada para la detección de infecciones como las de Toxocara canis, Dirofilaria immitis, Leishmania infantum, Babesia bovis, B. bigemina, Anaplasma marginale y T. gondii17.Hasta la fecha, se han realizado muy pocos estudios para detectar antígenos o anticuerpos contra T. gondii utilizando Dot-ELISA.15,18,19 Según el leal saber y entender de los autores, no se han realizado estudios para evaluar Dot-ELISA basados ​​en antígenos recombinantes de T. gondii SAG1 (rSAG1) y GRA7 (rGRA7) en suero humano.Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue evaluar un Dot-ELISA interno basado en varios antígenos de T. gondii como rSAG1, rGRA7, combinación de rSAG1 y rGRA7 y antígenos de taquizoítos solubles (STAg) para el serodiagnóstico de la toxoplasmosis humana. .Los resultados se compararon con los de ELISA estándar.Se usó E. coli BL21 (DE3) pLysS (Promega, EE. UU.) para expresar antígenos recombinantes.Se utilizó el plásmido pET28a (Novagen, EE. UU.) para construir un sistema de expresión.Las células de E. coli con plásmidos se cultivaron aeróbicamente a 30°C en medio Luria-Bertani (LB) suplementado con 50 μg/ml de kanamicina y 50 μg/mL de cloranfenicol.Las enzimas de restricción se adquirieron de New England Biolabs (EE. UU.) y los reactivos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de CinnaGen (CinnaGen, Irán).El sistema de purificación que utiliza resina de ácido nitrilotriacético de níquel (Ni-NTA) (Qiagen, Alemania) fue proporcionado por Invitrogen (EE. UU.).El isopropil-D-tiogalactopiranósido (IPTG), la agarosa y los reactivos de purificación de proteínas se adquirieron de Sigma-Aldrich (EE. UU.).La membrana NC se adquirió de Bio-Rad (EE. UU.).Los conjugados marcados con peroxidasa de rábano picante (HRP) anti-IgG e IgM humana de cabra, el sustrato de diaminobencidina (DAB) y los marcadores proteicos preteñidos se adquirieron de Sigma-Aldrich (EE. UU.).El estudio se llevó a cabo de acuerdo con las normas éticas de los comités de investigación institucionales y/o nacionales y la Declaración de Helsinki de 1964. Los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las Pautas para el cuidado y uso de animales de laboratorio publicadas por los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos. y aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Ciencias Médicas de Teherán, Teherán, Irán.El estudio actual fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Ciencias Médicas de Teherán el 11 de abril de 2016 (Aprobación No. 29,999).Además, los participantes firmaron consentimientos informados por escrito antes de iniciar el estudio.En caso de que la persona sea analfabeta, el consentimiento informado se puede dar mediante la huella dactilar y la firma de un testigo imparcial.Se obtuvo el consentimiento de los padres o tutores de los participantes menores de 16 años incluidos en este estudio.Varios laboratorios clínicos en Teherán y Shahriar, Irán, proporcionaron muestras de suero humano desde mayo de 2016 hasta noviembre de 2017. En el estudio retrospectivo actual, las muestras de suero humano se analizaron utilizando kits comerciales de ELISA para Toxoplasma IgG e IgM (Trinity Biotech, EE. UU.) como referencia. para la detección de IgG (Toxo IgG) e IgM (Toxo IgM) específicas de T. gondii de acuerdo con las instrucciones del fabricante.Se eligió ELISA como referencia, ya que es la prueba clásica y más utilizada para la detección de anticuerpos específicos de T. gondii en sueros de pacientes y la prueba estándar de diagnóstico en nuestro laboratorio.19 Un total de 224 sueros se dividieron en 3 grandes grupos según a criterios clínicos y serológicos,20 de la siguiente manera: 1) Grupo I, sueros de infección crónica (CIS) que incluye 80 muestras positivas para anti-T.gondii IgG y anti-T.gondii IgM con una muestra de seguimiento que indica que no hay aumento de IgG ni presencia de IgM;2) Grupo II, sueros de infección aguda (AIS) que incluye 32 muestras positivas para anti-T.gondii IgM y sueros también tuvieron muy baja avidez en el ensayo de avidez (VIDAS Toxo IgG Avidity, bioMerieux, Francia) y todos estos pacientes tenían signos de linfadenopatía;y 3) Grupo III, sueros de infección negativos (NIS) que incluye 112 muestras negativas para anti-T.gondii anticuerpos IgG e IgM.Cuatro muestras fueron excluidas de análisis posteriores, por ser positivas para anti-T.gondii IgM y tuvo una avidez alta o equívoca en el ensayo de avidez sin ningún signo de linfadenopatía, lo que sugiere que la IgM sola no es un marcador preciso de fase aguda.Para garantizar un análisis ciego, a cada muestra se le dio un código de identificación único.A continuación, se utilizaron muestras de cada entorno (CIS, AIS, NIS) para la evaluación del rendimiento de las tiras Dot-ELISA internas con varios antígenos para la detección de anticuerpos específicos contra el toxoplasma humano según el número de identificación.Para los estudios de reactividad cruzada, se probaron tiras Dot-ELISA internas frente a sueros humanos correspondientes a infecciones parasitarias distintas de la toxoplasmosis, incluidas F. hepatica (n=3), L. infantum (n=3), Echinococcus granulosus (n= 4) y paludismo (n=5).Se utilizaron los kits comerciales de ELISA (Trinity Biotech Captia, EE. UU.) para detectar Toxo IgG e IgM de acuerdo con las instrucciones del fabricante.En primer lugar, los anticuerpos específicos del suero contra T. gondii se unieron con el antígeno recubierto de T. gondii en la superficie de los pocillos de reactivo para formar complejos antígeno-anticuerpo.Se utilizó IgG o IgM antihumana de cabra marcada con HRP como anticuerpo secundario para el complejo antígeno-anticuerpo.Después de la incubación y el lavado, se añadió a cada pocillo un sustrato cromógeno de 3,3´,5,5´-tetrametilbencidina (TMB) para detectar la actividad de HRP.El proceso se detuvo mediante la adición de solución de parada (H2SO4 1-N) y se registró la densidad óptica (DO) utilizando un lector ELISA automatizado (Biotek, EE. UU.) a 450 nm.Se utilizaron sueros calibradores y de control en cada conjunto de prueba.La relación del estado inmunológico (ISR) de las muestras se calculó dividiendo la DO de la muestra por el valor límite (límite = DO media de los calibradores × factor de corrección).Los resultados se interpretaron de la siguiente manera según las recomendaciones del fabricante: los sueros <0,9 ISR se informaron como no reactivos, 0,91–1,09 como equívocos y >1,1 como reactivos.19Los plásmidos de expresión recombinante se construyeron y purificaron con éxito en el laboratorio como se describió anteriormente.21,22 En resumen, los amplicones de PCR se amplificaron usando ADN extraído de cepas RH de T. gondii.Luego, los productos de PCR se purificaron y clonaron en vectores pET28a en sitios de restricción específicos.Los plásmidos recombinantes resultantes que contenían los genes SAG1 y GRA7 se etiquetaron como pET28a/SAG1 y pET28a/GRA7, respectivamente.La cepa de E. coli BL21 (DE3) pLysS transformada con pET28a/SAG1 o pET28a/GRA7 se cultivó durante la noche en caldo LB suplementado con 50 μg/mL de kanamicina y 50 μg/mL de cloranfenicol a 37 °C con una agitación de 200 rpm .Luego, se inocularon 100 mL de medio LB, suplementado con los mismos antibióticos, con 2 mL del cultivo de la noche a la mañana.La temperatura disminuyó 30 °C con agitación vigorosa hasta que se logró una DO de 0,5 a 0,6 a 600 nm.A continuación, se indujo la producción de proteínas utilizando IPTG hasta una concentración final de 1 mM.El cultivo se hizo crecer a 30°C durante 16 horas con una agitación de 200 rpm.Las células se recolectaron mediante centrifugación a 5000 × g durante 5 minutos y se sometieron a purificación de proteínas.La proteína recombinante etiquetada con histidina se purificó a través del sistema de purificación usando resina Ni-NTA de acuerdo con las instrucciones del fabricante en condiciones desnaturalizantes y nativas para las proteínas SAG1 y GRA7, respectivamente.Brevemente, los sedimentos celulares se resuspendieron en tampón de lisis A1 para la purificación de la proteína His6-SAG1 (8 M de urea, 20 mM de NaH2PO4, 500 mM de NaCl [pH 8], 1 mg/mL de lisozima y cóctel de inhibidores de proteasa) o tampón de lisis A2 para His6-GRA7 (50 mM de NaH2PO4, 500 mM de NaCl [pH 8], 1 mg/mL de cóctel de lisozima e inhibidor de proteasa) (Roche Applied Science, Suiza).Las suspensiones se sonicaron durante 30 pulsos durante al menos 15 veces a intervalos de 1 minuto en un baño de mezcla de hielo y agua usando una micropunta (Branson Ultrasonic Corporation, Danbury, EE. UU.).Las fracciones solubles se recogieron mediante centrifugación a 8000 × g durante 30 minutos a 4 °C.Los gránulos lavados que contenían proteínas de cuerpos de inclusión insolubles se extrajeron usando 8 M de urea en tampón de extracción (20 mM de NaH2PO4 y 500 mM de NaCl, pH 6,3) complementado con un cóctel inhibidor de proteasa.Las proteínas solubilizadas se incubaron con resina Ni-NTA durante 30 a 60 minutos con agitación suave para mantener la resina suspendida en la solución de lisado a temperatura ambiente.Los antígenos recombinantes se lavaron dos veces con 8 ml de tampón de lavado B20 (tampón A1 o A2 que contenía 20 mM de imidazol) y dos veces con tampón de lavado B50 (tampón A1 o A2, que contenía 50 mM de imidazol).Las proteínas recombinantes se eluyeron con 8-12 ml de tampón de elución C (tampón A1 o A2, que contenía 250 mM de imidazol).Las fracciones eluidas se dializaron frente a un tampón de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (1 % de NaCl p/v, 0,075 % de KCl p/v, 0,14 % de Na2HPO4 p/v y 0,0125 % de KH2PO4 p/v).Los tamaños de las proteínas diana expresadas se determinaron usando electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio al 12% (SDS-PAGE) y tinción con azul de Coomassie.La concentración de las proteínas recombinantes purificadas se evaluó utilizando el ensayo de Bradford (Bio-Rad, EE. UU.) y albúmina de suero bovino (BSA) como estándar.Las soluciones de proteínas se ajustaron a 2 mg/ml, se dividieron en pequeñas alícuotas y se almacenaron a -80 °C hasta su uso.La SAG1 desnaturalizada purificada se replegó mediante diálisis en gradiente de urea antes de evaluar el contenido de proteínas mediante el ensayo de Bradford.Las proteínas se cargaron en una bolsa de diálisis con un límite de masa molecular de membrana de 13.000 Da y se dializaron frente a 100 volúmenes de tampón (20 mM de NaH2PO4 y 500 mM de NaCl, pH 8) a 4 °C durante casi 20 horas.Los desnaturalizantes se eliminaron lentamente mediante diálisis en serie con una concentración de urea descendente de 6 a 3 y a 1,5 y luego a 0 M en 10 mmol/L de PBS, pH 7,23,24.Las inmunorreactividades de las proteínas recombinantes se determinaron mediante análisis de transferencia Western.Después de la electroforesis, las proteínas se transfirieron a la membrana NC.Las membranas se bloquearon con PBS que contenía 5 % de leche desnatada (PBS-M 5 %) durante 1 h a temperatura ambiente y luego se lavaron 3 veces con PBS que contenía 0,1 % de Tween 20 (PBS-T 0,1 %) durante 5 min.Luego, las membranas se incubaron con sueros humanos positivos para T. gondii diluidos 1:100 en solución de bloqueo durante 2 horas a temperatura ambiente.Después de tres lavados, las membranas se incubaron con conjugado marcado con peroxidasa anti-IgM humana diluido 1:2000 en leche desnatada durante 1 h con agitación.Luego, se lavaron las membranas y se detectaron las proteínas usando DAB como sustrato cromogénico.Se usaron marcadores de proteína preteñidos para SDS-PAGE y transferencia Western.La STAg se preparó a partir de taquizoitos de T. gondii como se describió previamente.25 Brevemente, los taquizoitos RH de T. gondii se inocularon por vía intraperitoneal en ratones BALB/c.En el día 5 después de la infección, los taquizoítos se recogieron de la cavidad abdominal de los ratones usando un lavado de peritoneo con PBS estéril (pH 7,4).Los taquizoítos se lavaron 3 veces con PBS y luego se sonicaron y centrifugaron a 14 000 × g durante 1 hora a 4 °C.Los sobrenadantes se filtraron a través de filtros de papel Whatman® No. 1 y luego se dividieron en pequeñas alícuotas y se almacenaron a -20 °C hasta su uso.La cantidad de proteína de las muestras se evaluó posteriormente mediante el ensayo de Bradford.Dot-ELISA se realizó con base en los protocolos estandarizados descritos anteriormente con optimización de las concentraciones de antígeno recombinante, dilución de muestras de suero y conjugados de anticuerpos secundarios.26 Generalmente, las NC con poros de 0,22 μm se cortaron en tiras de 0,8 mm de ancho y 5 cm de largo. .Luego, varias cantidades de STAg, rSAG1 y rGRA7 purificados de T. gondii y combinaciones de rSAG1 y rGRA7 (1: 1, 2: 1 y 1: 2) se salpicaron en NC seguido de incubación durante 45 minutos a temperatura ambiente.Después del secado, los sitios de unión a proteínas no específicas se bloquearon mediante la adición de PBS-M al 5% (pH 7,4) antes de la incubación con muestras de suero.Luego, las muestras de suero se diluyeron con PBS-M al 3% y se agregaron a las tiras.Después de la incubación a 37 °C durante 45 min, las tiras se lavaron 3 veces en PBS-T al 0,1 %.La IgG humana unida se detectó añadiendo conjugados de cabra anti-IgG humana marcados con HRP a las tiras.La IgM humana se detectó usando IgM antihumana de cabra conjugada con HRP.Después de la incubación a 37°C durante 45 min, las tiras se lavaron 3 veces más y se empaparon con una solución fresca de DAB y se incubaron durante 10 min, se enjuagaron con agua destilada (DW) y se secaron.Cada tira Dot-ELISA interna se analizó utilizando suero de cada categoría.Las muestras con manchas marrones (en comparación con los sueros de control negativos y positivos, los antígenos y los controles de anticuerpos secundarios) se informaron como positivas.La concentración óptima de cada antígeno utilizado en la prueba se evaluó utilizando cuatro concentraciones de antígenos (1,25, 2,5, 3,75 y 5 μg/mL) y se probó utilizando sueros de control positivo y negativo.La sensibilidad, la especificidad, el valor predictivo positivo, el valor predictivo negativo, la validez y la concordancia relativa de las tiras Dot-ELISA internas se calcularon para cada antígeno de la siguiente manera: sensibilidad=TP/TP+FN×100, especificidad=TN/TN+FP ×100, valores predictivos positivos=TP/TP+FP×100, valores predictivos negativos=TN/TN+FN×100, validez=sensibilidad+especificidad/2 y concordancia relativa=TP+TN/TP+TN+FP+FN× 100;cuando TP fue verdadero positivo (Nº de muestras positivas con ambas pruebas), FP fue falso positivo (Nº de muestras positivas con tiras Dot-ELISA internas y negativas con ELISA), TN fue verdadero negativo (Nº de muestras negativas con ambas pruebas) y FN fue falso negativo (Nº de muestras negativas con tiras Dot-ELISA internas y positivas con ELISA).La estabilidad de las tiras se evaluó utilizando sueros estándar positivos y negativos.Se almacenaron diez tiras, respectivamente, durante 2, 4 y 6 meses a temperatura ambiente.Las tiras almacenadas se volvieron a analizar en cuanto a especificidad y sensibilidad con sueros humanos positivos o negativos conocidos para T. gondii.El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando el software SPSS v.20 (IBM Analytics, EE. UU.).Los datos se informaron mediante el cálculo de frecuencias (%) e intervalos de confianza del 95%.Además, se utilizó la prueba Kappa (κ) para calcular el grado de acuerdo entre el Dot-ELISA interno y el Trinity ELISA de acuerdo con un método descrito originalmente por Landis y Koch.27 La fuerza del acuerdo se evaluó mediante κ, con valores interpretados como pobre (κ≤0), leve (0<κ≤0.20), justo (0.21<κ≤0.40), moderado (0.41<κ≤0.60), sustancial (0.61<κ≤0.80) y casi perfecto acuerdo ( 0,81<κ≤1,0).La precisión de las tiras Dot-ELISA internas para la detección de exposiciones a T. gondii se evaluó mediante la sensibilidad y la especificidad.Los valores predictivos positivos y negativos se informaron de acuerdo con un método de Jacobson.28 Los valores de P inferiores a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.Los genes SAG1 (1011 pb) y GRA7 (711 pb) se amplificaron a partir de ADN genómico de taquizoítos y se clonaron con éxito en vectores pET28a.Las colonias positivas se verificaron mediante PCR con cebadores específicos de genes, enzimas de restricción y secuenciación.La digestión de pET28a/SAG1 con las endonucleasas EcoRI y XhoI produjo dos bandas de 5369 y 1011 pb para pET28a y SAG1, respectivamente (Figura 1A).Después de la digestión de pET28a/GRA7 usando las nucleasas BamHI y NotI, se produjeron dos bandas de 5369 pb para pET28a y 711 pb para GRA7 (Figura 1B).Los resultados de la secuenciación revelaron una similitud del 100 % con las secuencias de los genes SAG1 y GRA7 previamente registradas en la base de datos GenBank (números de acceso MK250980 y MK250981).Los plásmidos recombinantes verificados se transformaron en el sistema bacteriano de expresión pLysS BL21 (DE3).Figura 1 Electroforesis en gel de agarosa al 1,5 % de (A) pET28a/SAG1 recombinante digerido y (B) pET28a/GRA7 recombinante.(A) Carril 1, pET28a/SAG1 no digerido;Carril 2: pET28a/SAG1 digerido con EcoRI y XhoI;Carril M, escalera de ADN de 1 kb.(B) Calle 1, pET28a/GRA7 no digerido;Carril 2, pET28a/GRA7 digerido con BamHI y NotI;Carril M, escalera de ADN de 1 kb.Figura 1 Electroforesis en gel de agarosa al 1,5 % de (A) pET28a/SAG1 recombinante digerido y (B) pET28a/GRA7 recombinante.(A) Carril 1, pET28a/SAG1 no digerido;Carril 2: pET28a/SAG1 digerido con EcoRI y XhoI;Carril M, escalera de ADN de 1 kb.(B) Calle 1, pET28a/GRA7 no digerido;Carril 2, pET28a/GRA7 digerido con BamHI y NotI;Carril M, escalera de ADN de 1 kb.Se indujo la expresión de rSAG1 y rGRA7 utilizando 1 mM de IPTG cuando las células crecieron hasta una DO de 0,6 a 600 nm durante 16 horas.Los antígenos SAG1 y GRA7 de T. gondii recombinantes que contenían 6 residuos de histidilo en los terminales N y C se expresaron en E. coli con masas moleculares calculadas de 37 y 26 kDa, respectivamente.Estas proteínas recombinantes se purificaron con éxito mediante cromatografía de un solo paso y resina Ni-NTA.Además, las proteínas recombinantes purificadas se verificaron usando Western blot con sueros humanos de pacientes infectados con Toxoplasma.En cada caso, se observaron bandas de 37 y 26 kDa para las proteínas SAG1 y GRA7, respectivamente.No se detectaron bandas en los carriles de control de vectores (Figura 2).Figura 2 Western blot sondeado con sueros de pacientes con toxoplasmosis.(A) Carril 1, proteína rSAG1 purificada;Carril 2, lisados ​​BL21 que contienen solo el vector pET28a;Carril M, marcador de proteína de 10–180 kDa.(B) Carril 1, lisados ​​BL21 que contienen solo el vector pET28a;carril 2, proteína rGRA7 purificada;Carril M: marcador de proteína de 10–180 kDa.Las flechas indican proteínas rSAG1 y rGRA7 purificadas a aproximadamente 37 y 26 kDa, respectivamente.Figura 2 Western blot sondeado con sueros de pacientes con toxoplasmosis.(A) Carril 1, proteína rSAG1 purificada;Carril 2, lisados ​​BL21 que contienen solo el vector pET28a;Carril M, marcador de proteína de 10–180 kDa.(B) Carril 1, lisados ​​BL21 que contienen solo el vector pET28a;carril 2, proteína rGRA7 purificada;Carril M: marcador de proteína de 10–180 kDa.Las flechas indican proteínas rSAG1 y rGRA7 purificadas a aproximadamente 37 y 26 kDa, respectivamente.En el presente estudio, las concentraciones óptimas de STAg y antígenos recombinantes incluyeron 2,5 µg para la detección de Toxo IgG y 3,75 µg para la detección de Toxo IgM utilizadas en pruebas apropiadas para recubrir tiras NC.La dilución óptima de conjugados incluía 1:2000 usando titulación de tablero de ajedrez.Durante la optimización de antígenos y conjugados, los puntos marrones en las tiras NC en los sitios recubiertos de antígeno eran claramente visibles hasta los valores de dilución 1:50 de las muestras de suero de control positivo y, por lo tanto, se usó una dilución de suero 1:50 para obtener más puntos internos. -Pruebas ELISA.Las reacciones positivas se visualizaron como manchas marrones.Los resultados se informaron como no reactivos cuando no se observaron colores (Figura 3).En las tablas 1, 2 y 3, respectivamente, se muestran muestras positivas y negativas de tiras Dot-ELISA internas con varios antígenos para la detección de anticuerpos Toxo IgG e IgM solos y Toxo IgG e IgM combinados.Además, se calcularon parámetros intrínsecos que incluyen sensibilidad y especificidad, valores predictivos positivo y negativo, validez, concordancia relativa y estadísticas kappa (κ) para cada antígeno de las tiras Dot-ELISA internas, en comparación con las de ELISA comercial para la detección de anticuerpos anti-Toxoplasma.La Tabla 4 muestra los resultados de las tiras de ELISA Toxo IgG Dot hechas en casa con varios antígenos, en comparación con los de ELISA.Los resultados del estudio actual en sueros del grupo I (CIS) mostraron que las sensibilidades más altas se lograron con STAg y antígenos combinados rSAG1 y rGRA7 de tiras para Toxo IgG con 88,7% y 86,2%, respectivamente.Además, la mayor especificidad, validez, concordancia relativa y valor kappa se lograron con los antígenos rSAG1 y rGRA7 combinados de las tiras con 91,1 %, 88,6 %, 89 % y 0,77, respectivamente (Tabla 4).La sensibilidad alcanzada con el antígeno GRA7 fue la más baja (66,2%) para Toxo IgG en CIS.Los resultados de las tiras IgM Dot-ELISA internas con varios antígenos se resumen en la Tabla 5. Los resultados del estudio en el grupo AIS mostraron que para la detección de Toxo IgM, STAg solo y combinados rSAG1 y rGRA7 dieron como resultado una sensibilidad del 90,6%, mientras que GRA7 y Los antígenos SAG1 solos mostraron una sensibilidad del 87,5 % y del 81,2 %, respectivamente (Tabla 5).La sensibilidad relativa, la especificidad, la validez y la concordancia para rSAG1 y rGRA7 combinados utilizando una tira Dot-ELISA interna para detectar Toxo IgM fueron del 90,6 %, 92 %, 91,3 % y 91,7 %, respectivamente (Tabla 5).Los resultados de la comparación de varios antígenos de Dot-ELISA interno con ELISA para Toxo IgG e IgM se presentan en la Tabla 6. Para la detección de Toxo IgG e IgM, STAg solo y una combinación de los dos antígenos (rSAG1+rGRA7) fueron más sensibles (89,3% y 87,5% respectivamente).En total, se calcularon los siguientes parámetros intrínsecos para Toxo IgG e IgM rSAG1+rGRA7 de las tiras Dot-ELISA internas, en comparación con las de ELISA: sensibilidad del 87,5 %, especificidad del 91,1 %, validez del 89,3 % y más VPP y VPN del 90,7% y 87,9%, respectivamente (Cuadro 6).Ningún suero de infección parasitaria no toxogénica reaccionó con varios antígenos de las tiras Dot-ELISA internas.Tabla 1 Resumen de resultados de tiras Dot-ELISA internas con varios antígenos para la detección de anti-T.gondii IgG en 192 sueros, en comparación con los resultados de ELISATabla 2 Resumen de resultados de tiras Dot-ELISA internas con varios antígenos para la detección de anti-T.gondii IgM en 144 sueros, en comparación con los resultados de ELISATabla 3 Resumen de los resultados de las tiras Dot-ELISA internas con varios antígenos para la detección de anti-T.gondii IgG e IgM en 224 sueros, en comparación con los resultados de ELISATabla 4 Evaluación de tiras Dot-ELISA internas con varios antígenos para la detección de anti-T.gondii IgG en 192 sueros, comparado con el de ELISATabla 5 Evaluación de tiras Dot-ELISA internas con varios antígenos para la detección de anti-T.gondii IgM en 144 sueros, en comparación con el de ELISATabla 6 Evaluación de tiras Dot-ELISA internas con varios antígenos para la detección de anti-T.gondii IgG e IgM en 224 sueros, en comparación con el de ELISAFigura 3 Patrones de reactividad de la tira Dot-ELISA interna con varios antígenos para la detección de anti-T.gondii, anticuerpos.Cinco tiras se muestran en la figura como ejemplos.Todas las direcciones son de arriba hacia abajo.Tira 1, reacción positiva de STAg, combinación de rSAG1 y rGRA7 (1:1), rGRA7 y rSAG1 y reacción negativa de control negativo con sueros de pacientes.Tira 2, reacción positiva de STAg, combinación de rSAG1 y rGRA7 (1:1), rGRA7 y reacción negativa de rSAG1 y control negativo con sueros de pacientes.Tira 3, reacción positiva de STAg, combinación de rSAG1 y rGRA7 (1:1), rSAG1 y reacción negativa de rGRA7 y control negativo con sueros de pacientes.Tira 4, reacción positiva de combinación de rSAG1 y rGRA7 (1:1), rSAG1, rGRA7 y reacción negativa de STAg y control negativo con sueros de pacientes.Tira 5, reacción positiva de STAg, combinación de rSAG1 y rGRA7 (1:1), rGRA7 y rSAG1 y reacción negativa de control negativo con sueros de pacientes.Tabla 1 Resumen de resultados de tiras Dot-ELISA internas con varios antígenos para la detección de anti-T.gondii IgG en 192 sueros, en comparación con los resultados de ELISATabla 2 Resumen de resultados de tiras Dot-ELISA internas con varios antígenos para la detección de anti-T.gondii IgM en 144 sueros, en comparación con los resultados de ELISATabla 3 Resumen de los resultados de las tiras Dot-ELISA internas con varios antígenos para la detección de anti-T.gondii IgG e IgM en 224 sueros, en comparación con los resultados de ELISATabla 4 Evaluación de tiras Dot-ELISA internas con varios antígenos para la detección de anti-T.gondii IgG en 192 sueros, comparado con el de ELISATabla 5 Evaluación de tiras Dot-ELISA internas con varios antígenos para la detección de anti-T.gondii IgM en 144 sueros, en comparación con el de ELISATabla 6 Evaluación de tiras Dot-ELISA internas con varios antígenos para la detección de anti-T.gondii IgG e IgM en 224 sueros, en comparación con el de ELISAFigura 3 Patrones de reactividad de la tira Dot-ELISA interna con varios antígenos para la detección de anti-T.gondii, anticuerpos.Cinco tiras se muestran en la figura como ejemplos.Todas las direcciones son de arriba hacia abajo.Tira 1, reacción positiva de STAg, combinación de rSAG1 y rGRA7 (1:1), rGRA7 y rSAG1 y reacción negativa de control negativo con sueros de pacientes.Tira 2, reacción positiva de STAg, combinación de rSAG1 y rGRA7 (1:1), rGRA7 y reacción negativa de rSAG1 y control negativo con sueros de pacientes.Los patrocinadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.Los autores declaran no tener conflictos de interés en este trabajo.2ª ed.Toxoplasma gondii: de los animales a los humanos.Lanceta.Vectores de parásitos.J. Clin Microbiol.J. Clin Microbiol.J Immunol.Parasitol veterinario.Métodos J Microbiol.J Parasit Dis.Parasitol iraní J.Parasitol iraní J.Métodos Enzymol.Int J Nanomedicina.La medida del acuerdo del observador para datos categóricos.Biometría.Rev Sci Tech.Tendencias Parasitol.Vectores de parásitos.Clínica Bioquímica.Diagnóstico Microbiol Infect Dis.Ann Trop Med Parasitol.Laboratorio Clín.Mem Inst Oswaldo Cruz.Enferm Infecc Microbiol Clin.Inmunocelular.J Immunol.J Biol Chem.Ciencia de las proteínasCurr Opin Biotecnología.J. Clin Microbiol.Diagnóstico Microbiol Infect Dis.Tropa Biomédica.Los microbios infectan.J Med Microbiol.Métodos J Microbiol.© 2019 El(los) autor(es).Este trabajo está publicado y autorizado por Dove Medical Press Limited.Los usos no comerciales del trabajo están permitidos sin ningún otro permiso de Dove Medical Press Limited, siempre que el trabajo se atribuya correctamente.Reservados todos los derechos.Registrado en Inglaterra y Gales.Si acepta nuestro uso de cookies y el contenido de nuestra Política de privacidad, haga clic en 'aceptar'.